附錄Ⅻ A 無菌檢查法

　　附錄ⅫA無菌檢查法

　　無菌檢（jiǎn）查法係用於檢查藥典要求（qiú）無菌（jun1）的生物製品、醫療（liáo）器具、原料、輔料、及（jí）其他品種是否無（wú）菌的一種方法。若供試品符合無菌（jun1）檢查法的規定,僅表明了供試品在該檢驗條件下未發現微生物汙染。

　　無菌檢查應（yīng）在（zài）環境潔淨度10 000級下的局部潔淨度100級（jí）的單向流空氣區域內或隔離係統中進行，其全（quán）過程應（yīng）嚴格遵守無菌操作，防止微生物汙染，防止汙染的（de）措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區、工作台麵及環境應定期按《醫藥工業潔淨室（shì）（區）懸浮粒子、浮遊菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。隔離係統應（yīng）按相關的要求進行驗證，其內部（bù）環境的（de）潔淨度須符合無菌檢（jiǎn）查的要求。日常檢驗還需對試驗環境進行監控。

　　無菌檢查人員必須具備微生物專業知識，並經過無菌技術的培訓。

　　培養基

　　培養基的製備

　　培養基可按以下處方製備，亦可使（shǐ）用按該處方生產的符合規定的脫水培養基（jī）。配製後應采（cǎi）用驗（yàn）證合格的滅菌程序滅菌。製備好的培養基應保存在2℃～25℃、避光的環（huán）境（jìng），若保存於非密閉容器中，一般在三周內（nèi）使用；若保存於密閉容器中，一般可（kě）在一年內使用。

　　1.硫乙醇酸鹽流體培養基

　　酪腖(胰酶水解（jiě）)15.0g酵母浸出粉5.0g

　　葡（pú）萄糖5.0g氯化鈉2.5g

　　L-胱氨酸0.5g新配製的0.1%刃天青溶液1.0 ml

　　硫（liú）乙醇（chún）酸鈉0.5g瓊（qióng）脂0.75g

　　(或硫乙醇酸)（0.3 ml)水（shuǐ）1000 ml

　　除葡（pú）萄糖和刃天青溶液外（wài），取上述成分混合，微溫溶解（jiě），調節pH為弱堿（jiǎn）性，煮沸，濾清，加入葡（pú）萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH值使滅菌後（hòu）為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高（gāo）度的（de）比例應符（fú）合培養結束後培（péi）養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的1/2，滅菌。在供試品接（jiē）種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深（shēn）度（dù）的1/5，否則，須經（jīng）100℃水浴加（jiā）熱（rè）至粉紅色消（xiāo）失（不超（chāo）過20分鍾），迅速冷卻，隻限加熱一次，並防止被汙染。

　　2.改良馬丁培養基

　　腖5.0g磷酸氫二（èr）鉀1.0g

　　酵母浸出（chū）粉2.0g硫酸鎂0.5g

　　葡萄糖20.0g水1000 ml

　　除葡萄糖（táng）外，取上述成分混（hún）合，微溫溶解，調節pH值約為6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌（jun1）後為6.4±0.2，分裝，滅菌。

　　3.選擇性培養基

　　按上述硫乙醇酸（suān）鹽（yán）流體培養基或改良馬（mǎ）丁培養基的處方及製法，在培養基滅菌或使用前加入適宜的中和劑、滅活劑或表（biǎo）麵活性劑，其用（yòng）量同驗證試驗。

　　4.營養肉湯培養基（jī）

　　腖10.0g氯化鈉5.0g

　　牛肉（ròu）浸出粉3.0g水1000 ml

　　取上述成分混合，微溫（wēn）溶解（jiě），調節pH為弱堿性，煮沸，濾清（qīng），調節pH值使（shǐ）滅菌後為7.2±0.2，分裝，滅菌。

　　5.營養瓊脂培養基

　　按上述營養（yǎng）肉湯培養（yǎng）基的處方及（jí）製法，加入14.0g瓊脂，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，滅菌。

　　6.改良馬（mǎ）丁瓊（qióng）脂培養基

　　按改良馬丁（dīng）培養基的（de）處方及製法，加（jiā）入14.0g瓊脂，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，滅菌。

　　培養基的適用性檢查

　　無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁（dīng）培養基（jī）應符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢（jiǎn）查的（de）要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。

　　無（wú）菌性檢查每批培養基隨機抽取不少於10支（瓶），5支（瓶）置30℃～35℃另5支（瓶）置20℃～25℃培養14天，均應（yīng）無菌生長.

　　靈敏度檢查

　　菌種：培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代（dài）次（cì）數不得超（chāo）過5代（從菌種保存中心獲得的冷（lěng）凍幹燥菌種為第0代），試驗用（yòng）菌種應采用適宜的菌（jun1）種保存技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。

　　金黃色葡萄球（qiú）菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B)26 003〕

　　銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B)10 104〕

　　枯草（cǎo）芽（yá）孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕

　　生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B)64 941〕

　　白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F)98 001〕

　　黑曲黴(Aspergillus niger)〔CMCC(F)98 003〕

　　菌（jun1）液製備（bèi）接種金黃色葡萄（táo）球菌、銅綠假單（dān）胞菌（jun1）、枯草芽孢杆菌的（de）新鮮培養（yǎng）物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂（zhī）培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫（liú）乙醇酸鹽（yán）流體培養（yǎng）基中，30℃～35℃培養18小（xiǎo）時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁（dīng）培養基中或改良馬丁瓊脂培養基（jī）上，20℃～25℃培養（yǎng）24小（xiǎo）時～48小時，上述培養（yǎng）物用0.9%氯化鈉（nà）溶液製成每1ml含菌數小（xiǎo）於100 cfu（菌落形成（chéng）單位）的菌懸液。接種黑曲黴的新鮮培（péi）養物至改良馬丁瓊脂培養基上，23℃～28℃培養5天（tiān）～7天，加入3ml～5ml無菌的含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然（rán）後，用適宜的方法吸出（chū）孢子懸液至無菌試管內，用無菌的含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%氯（lǜ）化鈉溶液製成（chéng）每1ml含孢子數小於100 cfu的（de）孢（bāo）子懸液。

　　菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2℃～8℃可在24小時內使用。黑曲黴孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗（yàn）證過的貯存期內使（shǐ）用。

　　培養（yǎng）基接種取每管（guǎn）裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流（liú）體培養基9支，分別接種小於100 cfu的金黃色葡（pú）萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌、生（shēng）孢（bāo）梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照（zhào），置30℃～35℃培養3天；取每管裝量（liàng）為9ml的改良馬丁培養基5支,分（fèn）別接種小於100 cfu的白色念珠菌、黑曲黴各2支，另1支不接種作為空白（bái）對照，置20℃～25℃培養5天。逐日觀察結果。

　　結果判定空白對照（zhào）管（guǎn）應無菌生長，若加菌的培養基管（guǎn）均生長良好，判該培養基（jī）的靈敏度（dù）檢查符合規定。

　　稀釋液、衝洗液（yè）及（jí）其製備方法

　　稀釋液、衝洗液配製後應采用驗證合格的滅菌程（chéng）序滅菌。

　　1.0.1%蛋白腖水溶液取蛋白腖1.0g，加（jiā）水1000ml，微溫溶解，濾（lǜ）清，調節（jiē）pH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。

　　2.pH7.0氯化鈉-蛋白腖緩衝液取磷酸二氫鉀3.56g，磷酸（suān）氫（qīng）二鈉7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白腖1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝（zhuāng），滅菌（jun1）。

　　3.0.9%氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水（shuǐ）溶解（jiě）使成1000ml，過濾，分裝，滅菌(僅用（yòng）於上述兩種溶液不適用時使用)。

　　4.根據供試品的特性，可選用其他經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、衝洗液。

　　如需要，可在上述稀釋液或衝洗液的滅菌前（qián）或滅菌（jun1）後（hòu）加入表麵活性（xìng）劑或中和劑等。

　　方法驗證試驗（yàn）

　　當（dāng）建立產品（pǐn）的無菌檢（jiǎn）查法時，應進行方法的（de）驗證（zhèng），以（yǐ）證明所采用的方法適合於該產品的無菌檢查。若該產品的組分或（huò）原檢驗（yàn）條件發（fā）生改變時，檢（jiǎn）查方法應重新驗（yàn）證。

　　驗證時（shí），按"供試品的無菌檢查"的規定及（jí）下列要求（qiú）進（jìn）行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。

　　菌種及菌液製備同（tóng）培（péi）養基靈敏度檢查。

　　薄膜過濾法取每種培（péi）養基（jī）規定接種的供試品（pǐn）總量按薄膜過（guò）濾法過（guò）濾，衝（chōng）洗，在最後一次（cì）的衝洗液中加入小於100 cfu的試驗菌，過濾。將（jiāng）培養基加至濾（lǜ）筒內（nèi）。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗（yàn）菌，作為對照，細菌置30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培養3天～5天，逐日（rì）觀（guān）察各濾筒（tǒng）內試驗菌的生長情況。

　　直（zhí）接接種法取符合（hé）直接接種法培養基用量要（yào）求的（de）硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別（bié）接（jiē）入小於100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草（cǎo）芽孢杆菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接（jiē）種法培（péi）養基用量要求的改（gǎi）良馬丁培養基4管，分別接入小於100 cfu的（de）白色念珠菌、黑曲黴各2管。其中1管接入每（měi）支（zhī）培養基規定量的供試品量（liàng），另1管作為對照，細菌置30℃～35℃、真菌置20℃～25℃培養3天～5天，逐日觀察（chá）各濾筒內試驗菌的生長情況。

　　結果判斷與對照管比較，如含供（gòng）試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗（yàn）條件下無抑（yì）菌作用或其抑菌作用可以忽（hū）略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供（gòng）試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生（shēng）長微（wēi）弱、緩慢或不生長，則說明（míng）供試品的該檢驗量在該檢驗條件下（xià）有抑菌作用，可采用增加衝洗量、增加培養基的用量、使（shǐ）用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，並重新進行方法（fǎ）驗證試驗。

　　驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。

　　供試品的無菌檢查（chá）

　　抽驗數量是指一次試驗（yàn）所用供試品最小包裝容器的數量（支或瓶）。成（chéng）品每亞批均應（yīng）進行無菌（jun1）檢查。除另有（yǒu）規定（dìng）外，原液、半成品及成品按表1規定，上市產品監督檢驗按表2規定。

　　接種量是指每個（gè）最小包裝的（de）最少取樣量（ml或g）。除另有規定外，接種供試品量按表（biǎo）3規定。若采用（yòng）直接接種法，按接種量要求等（děng）量分別接種至硫乙（yǐ）醇（chún）酸鹽流（liú）體培養基和（hé）改良馬丁培養基中（兩種培養基的接種支（zhī）/瓶數之比為2：1）；若采用薄膜過濾法，應采用（yòng）三聯薄膜過濾器，其中兩聯加入硫乙醇酸鹽流體培養基，另一聯加入改良馬丁培養基。隻要供試品（pǐn）特性允許，應將所有容器（qì）內的內容物全部過（guò）濾。

　　陽性對照以金黃色葡萄球菌作為陽性（xìng）對（duì）照菌。供（gòng）試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量（liàng）。陽性對照試驗的菌液製備同培養基靈敏度檢查項下（xià）金黃色（sè）葡萄球菌菌液製備方法，加（jiā）菌量小於100cfu。陽性對照也可在（zài）供試（shì）品無（wú）菌檢查培養14天後，取其（qí）中一份硫乙醇酸鹽流體培養基，加入小於100cfu陽性對照菌，作為陽（yáng）性對照。陽性（xìng）對照置30℃～35℃培養48小時～72小時（shí）應生長良好。

　　陰性對照供試品無菌檢查時，應取（qǔ）相應溶劑（jì）、稀釋液和衝洗液同法操（cāo）作，作為陰性對照。陰性對照不得（dé）有菌生長。

　　無菌試驗過（guò）程中，若需使用（yòng）表麵（miàn）活性（xìng）劑、滅活（huó）劑、中和劑等試（shì）劑，應證明其有效性，且對微生物生長無毒性。

　　無菌（jun1）檢查法包括薄膜過濾（lǜ）法和直接接（jiē）種法。隻要供試品性狀允許（xǔ），應采用薄膜過濾法。供試品的無菌檢查所采用的檢查方法和檢驗條件應與驗證的方法（fǎ）相同。

　　操（cāo）作時，用適宜的消（xiāo）毒液（yè）對供試品容器表麵進行徹底消毒，如果供試品（pǐn）容（róng）器內有一定的真空度，可用適宜的無菌器（qì）材（如帶有除菌過濾器（qì）的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無菌操作起開容器取出內容物。

　　供試（shì）品處（chù）理及接種培養基

　　除另有規定外（wài），按下列方法進行。

　　1.薄膜過濾法

　　采用封閉式薄膜過濾器，濾膜（mó）孔徑應不大於0.45μm，直徑（jìng）約為50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。使用時，應保證濾膜在過濾前後（hòu）的完整（zhěng）性。

　　水溶性供試液過濾前先將少量（liàng）的衝洗液過濾（lǜ）以潤濕濾膜。油類供（gòng）試品，其濾（lǜ）膜和過濾器在使（shǐ）用前應充分幹燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及衝（chōng）洗液覆蓋整個濾（lǜ）膜表麵。供試液經薄膜過濾後，若需要用衝洗液（yè）衝洗濾膜（mó），每張濾膜每次衝洗量一般為100ml，總衝洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上（shàng）的微生物受損傷。

　　水溶液供試品取規定量，裝量小於10ml者，全部（bù）轉移至（zhì）含適宜稀釋液（yè）300ml的無菌容器內，混勻，立即過濾；裝量（liàng）為10ml及以上者直接過濾（lǜ），或全部轉移至（zhì）含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數一般不少於三次，所用的衝洗量、衝洗方法同方法驗證試驗。衝（chōng）洗後，兩個濾器中加入硫乙醇酸鹽（yán）流體培（péi）養基各100ml，另一濾器中加入改良馬丁培養基100ml。

　　水溶性固體供試品取規定量，加適宜的稀釋液溶解或（huò）按標簽說（shuō）明複溶，然後照水溶液供試品項下的方法（fǎ）操作（zuò）。

　　非水溶性（xìng）供試品取規定量，混合溶於（yú）含聚山（shān）梨（lí）酯80或（huò）其他適宜乳化劑的稀釋液300ml的無菌（jun1）容（róng）器內，充分混合，立（lì）即過濾。用（yòng）含0.1%～1%聚山梨酯80的（de）衝洗液衝洗濾膜，衝洗次數一般不少於三次。加入含或不（bú）含聚山梨酯80的培養基。其他照水溶液供試品項下的（de）方法操作。

　　可溶於十四烷酸異丙酯的膏劑（jì）和粘性油劑供試品取規定量，混合至適量（liàng）的無菌十四烷酸異丙酯①中，劇烈振搖，使供試品充分溶解（jiě），如果需要可適當（dāng）加熱，但溫度不得超過（guò）44℃，趁熱迅速過濾。對仍然（rán）無法（fǎ）過濾的供試品，於（yú）含有適量的無菌十（shí）四烷酸異丙酯（zhǐ）中的供試液中加入不少於100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾後濾膜衝洗及加入培（péi）養基照非（fēi）水溶性製劑（jì）供試品項下的方法操作。

　　無菌氣（噴）霧劑供（gòng）試品取規定量，將各容器（qì）置至少－20℃的冰室冷凍約1小時。以無菌操作迅（xùn）速在容器上端鑽一（yī）小孔，釋放拋射劑（jì）後再無菌開啟（qǐ）容器，並將供試液轉移至無菌容器中，然後照水溶液或非水溶性製劑供試品項（xiàng）下的方法操作。

　　裝有藥物的注射器（qì）供（gòng）試品取規定量，將注射器中的內容物（若需要可吸入稀釋液或標簽所示的溶劑（jì）溶解）直（zhí）接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混（hún）勻，立（lì）即過濾。然後按水溶性供試品項下方法操作。

　　同時應采用直（zhí）接接（jiē）種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。

　　注：①無菌十四烷（wán）酸異丙酯的製備采（cǎi）用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑（jìng）為0.22μm的脂溶性濾膜(140℃幹熱滅菌2小時)過（guò）濾。

　　2.直接接種法

　　直（zhí）接接種法（fǎ）適（shì）用於無法用薄膜過濾法進（jìn）行無菌檢（jiǎn）查的供試品（pǐn）。取規定量供試品,等量分別接種至硫乙（yǐ）醇酸鹽流體培養（yǎng）基（jī）和改良馬丁培養基中（兩種培養基的接種（zhǒng）支/瓶數（shù）之比為2：1）。除另有規定外，每個容器中培養基的（de）用量應（yīng）符合接種（zhǒng）的供試品體積（jī）不得大於培養（yǎng）基體積的10%，同時，硫乙醇酸（suān）鹽流體培養基每管裝量不少於15ml，改良馬丁培養（yǎng）基每管裝量不少（shǎo）於10ml。培養基的用量和高度同方法驗證試驗。

　　混懸（xuán）液等（děng）非澄清水溶液供試品取規定（dìng）量，等量分別接種至（zhì）各管（guǎn）培養基中。

　　固體供試品取規定量，加入（rù）適宜的稀釋劑溶解，或按標簽說明複（fù）溶後，混合，等量分別接種至各管（guǎn）培養基中。

　　非水（shuǐ）溶性（xìng）供試品取規（guī）定量，混合，加入（rù）適量的聚山梨酯80或其（qí）它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，等量（liàng）分別接種至各（gè）管培養基中。或等量分別直接接種至含聚山梨（lí）酯（zhǐ）80或其它適宜乳化劑的各管培養基中。

　　培養及觀察

　　將上述接種後（hòu）的硫乙醇（chún）酸鹽流體培養基平均分成兩份，一份置30℃～35℃培養14天；另一份與接種後的改良馬丁培養（yǎng）基置20℃～25℃培養14天（tiān），培養期間應逐日觀察並（bìng）記錄是（shì）否有菌（jun1）生長。如在加入供試品後、或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天後，不能從（cóng）外觀上判斷有無菌生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養（yǎng）基中及（jí）營養瓊脂斜麵和改良馬丁瓊脂斜麵培養基上，細菌培養2天、真菌培養3天，觀（guān）察接（jiē）種的（de）同種（zhǒng）新鮮培養基及營養瓊脂和改良馬丁瓊脂斜麵（miàn）培養基上是否有菌生長；或取培養液（物）塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌，必要時作（zuò）菌種鑒定。

　　結果判斷

　　陽性對照管應（yīng）生長良好，陰性對照管不得有（yǒu）菌生長。否則，試驗無（wú）效。

　　若供試品（pǐn）管均澄（chéng）清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判（pàn）供試（shì）品符合規（guī）定；若（ruò）供試品管中任何一（yī）管顯渾濁並確證有菌生長，判供（gòng）試品不符合規定（dìng），除非能充分證明試驗結果無效，即（jí）生長的微生物非供試品所含。當符合下列至（zhì）少一個條件時方可判試驗（yàn）結果無效：

　　⑴無菌檢查試驗所用的設備及環（huán）境的微生物監控結（jié）果不符合無菌檢查法的（de）要求。

　　⑵回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物汙染的因素。

　　⑶供試品管中生（shēng）長（zhǎng）的微生物經鑒定後，確證是因（yīn）無菌（jun1）試驗（yàn）中所使用的物品和（或）無菌操作技術不（bú）當引起的。

　　試驗若經確認無（wú）效，應（yīng）重試。重試時，重（chóng）新取同量供試品（pǐn），依（yī）法檢查，若無菌生長，判供試品符合（hé）規定；若有菌生長，判供（gòng）試品不符合（hé）規定。

　　表1出廠（chǎng）製品不同規格及原（yuán）液和半成品最少（shǎo）抽驗（yàn）數量

　　供試品

　　批（pī）產量(N)；裝量（V）

　　最（zuì）少抽（chōu）驗數（shù）量

　　注射劑

　　N≤100

　　5個

　　100＜N≤500

　　10個

　　N＞500

　　20個

　　凍幹血液製品（pǐn）

　　V＞5ml

　　每櫃凍幹N≤200個

　　5個

　　每櫃（guì）凍幹（gàn）N＞200個（gè）

　　10個

　　V≤5ml

　　N≤100

　　5個（gè）

　　100＜N≤500

　　10個

　　N＞500

　　20個

　　原液或半成品

　　每個容器取樣，取樣量為每個容器製品總量的0.1%或不少於10ml。每（měi）開瓶一次，應如（rú）上法抽驗。體外用診斷製品半成品每

　　批抽驗量應不少於3ml。

　　表2上市製品監督抽驗數量

　　品種及（jí）裝（zhuāng）量（V）

　　最少抽（chōu）驗數量

　　血液製品V＜50ml

　　6個

　　V≥50ml

　　2個

　　其他生物製品

　　10個

　　表3不同規格製品的最少接種量

　　規格

　　每支（瓶）供試品的最少接種量

　　液體製劑（ml）≤1

　　全量

　　1＜V≤5

　　半量

　　5＜V＜20

　　2ml

　　20≤V＜50

　　10ml

　　V≥50

　　半量

　　原液或半成品

　　半量

　　固體製劑＜50mg

　　全量

　　50mg≤M＜300mg

　　半量

　　300mg≤M＜5g

　　150mg

　　M≥5g

　　半量