凱氏定（dìng）氮儀原理和操作步驟

　　1.有機物中的胺根（gēn）在強熱和CuSO4，濃H2SO4作用下（xià），硝（xiāo）化生成（NH4）2SO4

　　反應式為

　　2NH2 H2S04 2H＝（NH4）2S04（其中CuSO4做催化劑）

　　2.在凱氏定（dìng）氮器（qì）中與堿（jiǎn）作（zuò）用，通過蒸（zhēng）餾釋放出NH3，收（shōu）集於H3BO3溶液中

　　反應式為:

　　（NH4）2SO4 2NaOH＝2NH3 2H2O Na2SO4

　　2NH3 4H3BO3＝（NH4）2B4O7 5H2O

　　3.用已知濃度的H2SO4（或HCI）標準溶液滴定，根據（jù）HCI消耗（hào）的量計算出氮的含量，然後乘以相應的換算因（yīn）子，既得蛋白質的含量點焊（hàn）機

　　反應式為（wéi）：

　　（NH4）2B4O7 H2SO4 5H2O＝（NH4）2SO4 4H3BO3（NH4）2B4O7 2HCl 5H2O＝2NH4Cl 4H3BO3

　　凱氏定氮（dàn）儀操作步驟：（一）消化1、準備6個凱氏燒瓶，標號。1、2、3號燒瓶（píng）中分別加入適當濃度的蛋白溶液1.0mL，樣（yàng）品要加到燒瓶底部，切勿沾在瓶口及瓶頸上。再依（yī）次加入硫酸鉀-硫酸銅接觸劑0.3g，濃硫（liú）酸（suān）2.0mL，30%過氧化氫1.0mL。4、5、6號燒瓶作為空白對照，用以測定（dìng）試劑中可能含有的微量含氮物質，對樣品測（cè）定進行校（xiào）正（zhèng）。4、5、6號燒瓶中加入蒸餾水1.0mL代替樣液，其餘所加試劑與1、2、3號燒瓶相同。2、將（jiāng）加好試劑的各燒瓶（píng）放置消化架上，接好抽氣裝置。先用微火加熱煮沸，此時燒瓶內（nèi）物質炭（tàn）化變黑（hēi），並產生大量泡沫，務（wù）必注意防止氣泡衝（chōng）出管口。待泡沫消失停止產生後，加大（dà）火力，保持瓶內液體微（wēi）沸，至溶液澄清後，再繼續加熱使（shǐ）消化液微沸15min。在消化過程中要隨時轉動燒瓶，以使內壁粘著物質均能流入底部，以保證樣品（pǐn）完全消化。消化時（shí）放出的氣體內含SO2，具有強烈刺激性，因此自始自終（zhōng）應打開抽（chōu）水泵將氣體抽入自來水排出。整個消化過程均應在通風（fēng）櫥中進行。消化完全後，關閉火焰，使燒瓶冷卻至室溫。（二（èr））蒸餾和吸收蒸餾和吸收是在微量凱氏定氮儀內進（jìn）行的。

　　凱氏定氮蒸餾裝置種類甚多，大體上都由蒸（zhēng）氣發生、氨的蒸餾和（hé）氨的吸收三部分組成。

　　1、儀器的洗滌儀器安裝前（qián），各部件需經一般方法洗滌幹淨，所用橡皮管、塞須（xū）浸在10%NaOH溶液中，煮約（yuē）10min，水洗、水煮10min，再水洗數次（cì），然後安裝並固定在一隻鐵架台上。儀器使用前，微量全部管道都須經水蒸氣洗滌，以除去管道內可能（néng）殘留的氨，正在使用的儀（yí）器，每次測樣前，蒸氣洗（xǐ）滌5min即可。較長時間未使用的儀器，重複蒸氣洗滌，不得（dé）少於三次，並（bìng）檢查儀器是否正（zhèng）常。仔細檢查各個連接處，保證不漏氣。首先在蒸氣發生器中加（jiā）約2/3體積蒸餾水，加（jiā）入數滴硫酸使其保（bǎo）持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影響結果，並放入少（shǎo）許沸石（或毛細管等），以防爆（bào）沸。沿小（xiǎo）玻杯壁加入蒸（zhēng）餾（liú）水約20mL讓水經插管流入反應室（shì），但玻杯內的水不要放光，塞上棒狀玻塞，保持水封，防止漏氣。蒸氣發（fā）生後，立即關（guān）閉廢液排放管上的開關，使蒸氣隻（zhī）能進入反應室，導致反應室內的水迅速沸騰，蒸（zhēng）出蒸氣由反應室上（shàng）端（duān）口通過定氮球進入冷凝管冷卻，在冷凝管下端放置一個錐形瓶接收冷凝水。從定氮球發燙開始（shǐ）計時，連續蒸煮5min，然後移（yí）開煤氣燈。衝洗完畢，夾緊蒸氣發生器與收集器之間的（de）連接橡膠管，由於氣體冷卻壓力降低，反應室內廢（fèi）液自動抽到反應室外殼中，打（dǎ）開廢液排出口（kǒu）夾子放出廢（fèi）液。如此清洗（xǐ）2～3次，再在冷凝管（guǎn）下換放一個盛有硼酸-指示（shì）劑混合液的（de）錐形（xíng）瓶使冷凝管下口完全浸（jìn）沒在（zài）溶（róng）液（yè）中，蒸餾1～2min，觀察錐形瓶（píng）內的溶（róng）液是否變色。如不變色，表示蒸餾裝置內（nèi）部已洗幹淨。移去錐形瓶，再蒸餾1～2min，用蒸餾水衝洗（xǐ）冷凝（níng）器下（xià）口，關閉煤氣燈，儀器即可供測樣品使用。

　　2、無機氮標準樣品的蒸餾吸收由於定氮操作繁瑣，為了熟悉蒸餾和滴定（dìng）的操（cāo）作（zuò）技術，初學者宜先用無機氮標準樣品進行反複練習，再進行有機氮未知樣品的測（cè）定。常用（yòng）巳知（zhī）濃度的標準硫酸銨測試三次。取潔淨的100mL錐形瓶五隻，依次加入2%硼酸溶液20mL，次（cì）甲基藍-甲基紅混合指示劑（呈紫紅色（sè））3～4滴，蓋好瓶口待（dài）用。取其中一隻錐形瓶承接在冷凝管下端，並使（shǐ）冷凝管的出口浸沒在溶液中。注意：在此操作之前必須先打（dǎ）開收集器活塞，以免（miǎn）錐（zhuī）形瓶內液體倒吸。準確吸取2mL硫酸銨標準液加到玻杯中，小心提起棒狀玻（bō）塞（sāi）使硫酸銨溶液慢慢流入蒸餾瓶中，用少量蒸餾水衝洗小（xiǎo）玻杯3次，一並放人蒸餾瓶中。然後用（yòng）量筒向小（xiǎo）玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液（yè），使堿液（yè）慢慢流入蒸（zhēng）餾（liú）瓶中，在（zài）堿液尚未完全流入（rù）時，將棒狀玻塞蓋緊（jǐn）。向小玻杯中加約5mL蒸餾水，再慢慢打開玻塞，使一半水流入蒸餾（liú）瓶，一半留在小玻杯中作水（shuǐ）封。關閉收（shōu）集器活塞，加熱（rè）蒸氣發生器，進行蒸餾。錐形瓶中的硼酸-指示劑混合液由於吸收了氨（ān），由紫紅色變成綠色。自變色時起，再蒸（zhēng）餾3～5min，移動錐形瓶使瓶（píng）內液（yè）麵離開冷（lěng）凝管下口約lcm，並用少量蒸餾水衝洗冷凝管下口，再繼續蒸餾1min，移（yí）開錐形瓶，蓋好，準備滴定。在一次蒸餾完（wán）畢後，移去煤氣（qì）燈，夾緊蒸氣（qì）發生器與收（shōu）集器間的橡（xiàng）膠管，排除反應完畢的廢液（yè），用水衝洗小玻杯幾次，並將廢液排除。如此反複衝洗幹淨後，即可進行下一個（gè）樣品的蒸餾。按以上方法用標（biāo）準硫酸銨再做（zuò）兩次（cì）。另取2mL蒸餾水代替標準硫酸銨進行空白測定二次。將各次蒸餾的錐形（xíng）瓶一（yī）起滴定。

　　3、未知（zhī）樣品及空白的蒸餾吸收（shōu）將消化好的蛋白樣品（pǐn）三支，空白對照液三支，依次作蒸餾吸收。加5mL熱的蒸餾水（shuǐ）至消化好的樣品或（huò）空（kōng）白對照液中，通過小玻杯加到反應室（shì）中（zhōng），再用熱蒸餾水洗滌小玻杯3次，每次用水量（liàng）約3mL，洗滌液一並倒入反應室內。其（qí）餘操作按（àn）標準硫酸銨的蒸餾（liú）進行。由於消化液內硫酸鉀濃度高而呈粘稠狀，不易從凱（kǎi）氏燒瓶內（nèi）倒出（chū），必須（xū）加入熱蒸餾水5 mL稀釋之，如果有結晶（jīng）析出，必須（xū）微熱溶解，趁熱加入玻（bō）杯，使其流入反應（yīng）室。此外，還應當注意趁儀器洗滌尚未完（wán）全冷卻時立即加入樣品或空白對照液，否（fǒu）則消化液通過冷卻的管道容（róng）易析出結晶，造成堵（dǔ）塞。（三）凱氏定氮儀滴定（dìng）樣品和空白蒸餾完畢後，一起進行滴定。打（dǎ）開接受瓶蓋，用酸式微量滴定管以（yǐ）0.0100mol/L的（de）標（biāo）準鹽酸溶液進（jìn）行滴（dī）定。待滴至瓶內溶液呈暗灰（huī）色（sè）時，用蒸餾（liú）水將錐形瓶內壁（bì）四周淋洗一次。若振搖後複現綠色，應再小心滴入標準鹽酸溶液半滴，振搖觀察瓶內溶液顏色變化，暗灰色在一二分鍾內不變，當視為到達滴定終點。若呈（chéng）粉紅色，表明已超越滴定終點，可在已滴定（dìng）耗用的標（biāo）準鹽酸溶液用量中減去0.02mL，每組樣品的（de）定氮終點顏（yán）色必須完全一致。空白對照（zhào）液接受瓶內的溶液顏色不變或略有（yǒu）變化尚未出（chū）現（xiàn）綠色，可以（yǐ）不滴定。記錄每次滴定耗用標準鹽酸溶液毫升數，供計算用。